Montelukast w terapii dysfunkcji pęcherza po urazie rdzenia kręgowego

Czym jest uraz rdzenia kręgowego i jakie wyzwania stawia dla układu moczowego?

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) dotyka rocznie około 40 przypadków na milion osób. Może on wystąpić w wyniku bezpośredniego urazu rdzenia kręgowego lub jako następstwo niedokrwienia naczyniowego, infekcji lub innych przyczyn. W odniesieniu do dolnego odcinka układu moczowego (LUT), SCI przerywa złożoną komunikację neuronalną, która jest niezbędna dla jego prawidłowego funkcjonowania. Uszkodzenia powyżej ośrodka mikcji krzyżowego (S2-S4) prowadzą do dyskoordynacji odruchu mikcji, powodując jednoczesne skurcze mięśnia wypieracza pęcherza i zwieracza cewki moczowej, określane jako dyssynergia wypieraczowo-zwieraczowa (DSD), co skutkuje wysokim ciśnieniem w pęcherzu. Te zmiany w LUT stanowią długoterminowe ryzyko dla górnych dróg moczowych. Ponad 90% pacjentów z SCI cierpi z powodu licznych objawów klinicznych, takich jak nietrzymanie moczu, duże objętości zalegającego moczu i nawracające infekcje dróg moczowych, co znacząco wpływa na jakość ich życia.

Obecne terapie, w tym doustne leki antymuskarynowe, receptory adrenergiczne beta-3 i iniekcje toksyny botulinowej, mają na celu złagodzenie różnych objawów neurogennej dysfunkcji dolnego odcinka układu moczowego (nLUTD) oraz ochronę górnych dróg moczowych. Jednak skutki uboczne leków, minimalny efekt terapeutyczny i pogarszanie się objawów często prowadzą do przerwania leczenia. Co najważniejsze, nie istnieje ustalona terapia zapobiegająca rozwojowi DSD i wywoływanym przez nią włóknistym zmianom w tkance pęcherza oraz ich konsekwencjom.

Mimo że ośrodkowy układ nerwowy jest uznawany za miejsce uprzywilejowane immunologicznie, SCI wywołuje przejściową ogólnoustrojową immunosupresję z orkiestrowaną inwazją krążących komórek odpornościowych, aktywacją rezydentnych komórek mikrogleju i astrocytów oraz ekspresją mediatorów immunologicznych i zapalnych, w tym dopełniacza, cytokin i chemokin, po SCI w kontekście neurozapalenia. Kwiecien i wsp. szczegółowo opisali mechanizmy patogenezy SCI i ścisły związek między postępującą astrogliozą a zmniejszeniem nasilenia stanu zapalnego w systematycznym badaniu SCI na gryzoniach. Ukierunkowanie na astrogliozę może być kluczowym mechanizmem generowania stanu sprzyjającego regeneracji i łagodzenia funkcjonalności, co jest również ważne dla narządów obwodowych.

Jednym z narządów dotkniętych ogólnoustrojową odpowiedzią zapalną jest pęcherz moczowy. Tak więc, podczas gdy zmiany w neuronalnym przekaźnictwie do pęcherza odgrywają oczywistą rolę, głównym czynnikiem przyczyniającym się do dysfunkcji pęcherza jest stan zapalny. Neurogenne zapalenie po SCI w LUT może być kluczowym czynnikiem w rozwoju DSD i zwłóknienia. Intensywne badania koncentrowały się na komórkowych mechanizmach leżących u podstaw neurogennego zapalenia w narządach miednicy. Biorąc pod uwagę dobrze udokumentowane zmiany zapalne w pęcherzu i ich szkodliwe skutki, zaskakujące jest, że tak niewiele badań analizowało potencjalne korzyści z leczenia przeciwzapalnego. Jedno z badań analizowało doustne podawanie cząsteczki przeciwzapalnej S-nitrozoglutationu po SCI i stwierdziło, że sprzyja ona odzyskiwaniu funkcji pęcherza poprzez hamowanie odpowiedzi zapalnych. Podobne efekty zaobserwowano przy stosowaniu simwastatyny, dantrolenu i kwercetyny, które wszystkie mają właściwości przeciwzapalne.

Czy leukotrieny i montelukast mogą stać się przełomem w terapii nLUTD?

Leukotrieny (LT), grupa wysoce aktywnych mediatorów lipidowych, są silnymi mediatorami zapalnymi zaangażowanymi w różne odpowiedzi biologiczne, w tym w patologie ośrodkowego układu nerwowego, takie jak SCI. W tkankach obwodowych, takich jak pęcherz moczowy, receptory leukotrienowe występują na komórkach mięśni gładkich i na lokalnych komórkach zapalnych. Komórki zapalne naciekające z krwiobiegu do uszkodzonej neurogennie tkanki pęcherza potęgują nadwrażliwość histaminową komórek mięśni gładkich wypieracza i pośredniczą w zapalnych zaburzeniach pęcherza. Wczesne hamowanie szlaku leukotrienowego za pomocą antagonisty receptora leukotrienowego może zmniejszyć neurogenne zapalenie w LUT po SCI, z możliwym korzystnym wpływem na DSD.

Aby to osiągnąć, montelukast, antagonista receptora cysteinyloleukotrienowego 1 i zatwierdzony przez FDA lek przeciwastmatyczny, może być dobrym kandydatem do repozycjonowania. Montelukast wykazał kilka korzystnych efektów na pęcherz moczowy. Doustne leczenie montelukastem znacznie zmniejszyło częstotliwość oddawania moczu i ból u pacjentów z śródmiąższowym zapaleniem pęcherza. Co jeszcze bardziej istotne, pojedyncza dootrzewnowa iniekcja montelukastu utrzymała integralność tkanki pęcherza po stłuczeniu SCI u szczurów. W odniesieniu do neurozapalenia w rdzeniu kręgowym, niedawne badania zidentyfikowały konieczność tłumienia astrogiliozy w celu złagodzenia neurozapalenia i podkreśliły, że montelukast przesunął równowagę reaktywnego stanu astrocytów w rdzeniach kręgowych samic myszy na korzyść funkcji proregeneracyjnej.

Jakie wyniki osiągnięto w badaniach pilotażowych nad funkcją pęcherza?

Biorąc pod uwagę dobrze ustalone właściwości przeciwzapalne montelukastu i jego długotrwałe zastosowanie kliniczne, przeprowadziliśmy krótkoterminowe badanie pilotażowe na samicach szczurów, aby zbadać jego potencjalny wpływ na wczesne pooperacyjne zmiany w pęcherzu po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego. Jednak w tym wstępnym badaniu leczenie montelukastem oceniano w ograniczony sposób – głównie poprzez monitorowanie poziomów leukotrienów w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym w ciągu czterech tygodni po urazie. Ponieważ patofizjologia neurogennej dysfunkcji dolnego odcinka układu moczowego (nLUTD) po SCI obejmuje złożone, zależne od czasu procesy zapalne i neuroplastyczne wpływające na rdzeń kręgowy i dolny odcinek układu moczowego, w tym badaniu uchwyciliśmy wczesny obraz wieloaspektowego procesu chorobowego.

W tym badaniu eksploracyjnym skupiliśmy się na dwóch głównych odkryciach: (i) potwierdzeniu istotnego stężenia montelukastu w osoczu u szczura z SCI oraz (ii) specyficznych dla pęcherza efektach montelukastu w modelu szczura z SCI. U zdrowych zwierząt kontrolnych stężenie montelukastu w osoczu było określane jedną, trzy i siedem godzin po podaniu i stopniowo zmniejszało się w czasie po przyjęciu, wynosząc 334 ± 85 ng/ml po jednej godzinie, 169 ± 11 ng/ml po trzech godzinach i 36 ± 17 ng/ml po siedmiu godzinach.

Po SCI stężenie montelukastu w osoczu było znacznie niższe u zwierząt z SCI, wynosząc 50,20 ng/ml (średnia, SCI) w porównaniu do 288,1 ng/ml (średnia, zdrowa kontrola), określone trzy godziny po podaniu w 29. dniu po urazie. W przypadku płynu mózgowo-rdzeniowego zaobserwowano odwrotną sytuację. U zdrowych zwierząt kontrolnych średnie stężenie wynosiło 1,61 ng/ml, podczas gdy u zwierząt z SCI było znacznie wyższe, ze średnią 18,82 ng/ml, określone trzy godziny po podaniu w 29. dniu po urazie.

Funkcja lokomotoryczna szczurów z SCI była oceniana na początku badania i trzy razy podczas obserwacji SCI w 1., 15. i 29. dniu po SCI. Wszystkie pomiary wyjściowe wykazywały spójne wyniki BBB wynoszące 21, wskazujące na brak wpływu implantów cewnika i noszonych uprzęży infuzyjnych na funkcję lokomotoryczną. W 1. dniu po SCI wszystkie zwierzęta z SCI, niezależnie od grupy, wykazywały wyniki między 0 a 1, wskazujące na całkowite porażenie. W 29. dniu po SCI zaobserwowano jedynie niewielkie odzyskanie funkcji motorycznych, z wynikami BBB wahającymi się między 1 a 8, z silnymi wahaniami w obu grupach (leczonej montelukastem i nieleczonej). Nie zaobserwowano zdolności do chodzenia u żadnego z naszych zwierząt z SCI, niezależnie od leczenia. Wszystkie zdrowe zwierzęta kontrolne miały spójne wyniki BBB wynoszące 21 przez cały okres obserwacji. Podsumowując, dysfunkcja lokomotoryczna była bardzo podobna u wszystkich zwierząt z SCI, niezależnie od grupy, z jedynie minimalnymi oznakami poprawy po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Funkcja pęcherza była oceniana na początku badania przed urazem i raz w tygodniu, począwszy od 1. dnia po urazie, do 4 tygodni. Wszystkie szczury wykazywały normalne i regularne mikcje podczas pomiaru wyjściowego. Podczas szoku rdzeniowego w pierwszym tygodniu po SCI wszystkie szczury wykazywały typowe pęcherze akontraktylne, z całkowitym zatrzymaniem i przepełnieniem moczu. Od drugiego tygodnia nieleczone i leczone montelukastem szczury z SCI ujawniły pierwsze różnice w wzorcach urodynamicznych, które rozwijały się dalej. Ogólnie rzecz biorąc, nieleczone szczury z SCI miały mniej częste i nieregularne mikcje, wraz z częstymi skurczami bez oddawania moczu. W przeciwieństwie do tego, grupa szczurów z SCI leczonych montelukastem wykazywała bardziej regularne, a na późniejszym etapie również częstsze mikcje, którym często nadal towarzyszyły skurcze bez oddawania moczu. Zalegające objętości (obliczane jako objętość infuzji – objętość oddanego moczu/na cykl mikcji) były wyższe u nieleczonych szczurów z SCI.

Wszystkie parametry ciśnieniowe były niższe u zwierząt leczonych montelukastem (zdrowe kontrolne i SCI), z istotnymi różnicami między dwiema grupami SCI z p = 0,000031 (maksymalne ciśnienie wypieracza), p = 0,000469 (minimalne ciśnienie mikcji), p = 0,000478 (ciśnienie progowe) i p = 0,000362 (średnie ciśnienie). W odniesieniu do parametrów mikcji, ponownie, wszystkie zwierzęta leczone montelukastem (zdrowe kontrolne i SCI) wykazywały niższe wartości parametrów: objętość oddanego moczu, czas mikcji i średni przepływ. Wśród dwóch grup SCI istniała znacząca różnica w objętości oddanego moczu (p = 0,003613). Nie zaobserwowano istotnych różnic w dwóch pozostałych parametrach. Porównawcza analiza wszystkich parametrów urodynamicznych między grupami zdrowych kontrolnych i SCI leczonych montelukastem nie wykazała istotnych różnic dla żadnego z analizowanych parametrów.

Wszystkie szczury wykazywały kliniczne i urodynamiczne oznaki obstrukcji: większe objętości podczas porannej opieki, większe zalegania po mikcji i wyższe ciśnienie w połączeniu z niższym przepływem. Podsumowując, nieleczone szczury z SCI wykazywały bardziej rozpowszechnione oznaki DSD z wyższymi ciśnieniami, mniej regularnymi zdarzeniami mikcji, większymi zaleganiami i tendencją do neurogennej obstrukcji odpływu pęcherza. Przeciwnie, szczury z SCI leczone montelukastem ujawniły mniej oznak DSD z mikcją o znormalizowanym ciśnieniu i małą ilością zalegań.

Zmiany strukturalne ściany pęcherza oceniano 4 tygodnie po wystąpieniu SCI za pomocą analiz histologicznych i immunohistochemicznych. Ze względu na wczesny punkt czasowy chroniczny, przeprowadzono jedynie jakościowe oceny tkanki. Wszystkie pęcherze SCI, leczone montelukastem lub nieleczone, wykazywały pogrubione ściany pęcherza w przeciwieństwie do zdrowych grup kontrolnych. W odniesieniu do stosunku kolagenu 1 i 3, szczury leczone montelukastem miały nieco mniej kolagenu 1, ale więcej kolagenu 3 niż nieleczone szczury. Nie zaobserwowano różnic w ułożeniu mięśni gładkich wypieracza i składzie macierzy pozakomórkowej podśluzówkowej między tkanką pęcherza SCI a zdrową. Włókna elastyczne pojawiały się zarówno w ich korkociągopodobnym kształcie, jak i częściowo rozciągnięte w mięśniach gładkich i w macierzy pozakomórkowej blaszki właściwej. Aby ocenić integralność i funkcję barierową uroepitelium, wykorzystano barwienie uroplakiny 3. Wszystkie pęcherze, zdrowe i SCI, wykazywały nienaruszone i ciągłe wyściółki nabłonkowe pozytywne dla uroplakiny 3. Podsumowując, nie zaobserwowano godnych uwagi różnic strukturalnych między pęcherzami SCI leczonymi montelukastem a nieleczonymi w tym wczesnym chronicznym punkcie czasowym 4 tygodni po SCI.

Celem tego badania było zbadanie wpływu montelukastu, antagonisty receptora cysteinyloleukotrienowego 1, na rozwój neurogennego pęcherza i zmiany strukturalne po całkowitym przecięciu SCI u szczurów. Funkcję pęcherza obserwowano przez 4 tygodnie po SCI, a następnie przeprowadzono analizę tkanki pęcherza. Kluczowym odkryciem tego badania pilotażowego było to, że montelukast miał pozytywny wpływ na zachowanie funkcji pęcherza po SCI. To odkrycie jest interesujące, ponieważ wybrany model urazu SCI był całkowitym przecięciem, aby wykluczyć jakąkolwiek zachowaną komunikację neuronalną z pęcherzem.

Na poziomie funkcjonalnym szczury z SCI leczone montelukastem miały niższe ciśnienia wewnątrzpęcherzowe, mniejsze objętości zalegającego moczu i lepszy profil mikcji. Ostatecznie, oprócz poprawy klinicznej, niemożliwe było wykluczenie obecności DSD u zwierząt z SCI leczonych montelukastem. Razem nasze wyniki pomiarów urodynamicznych i oceny klinicznej wskazują na zachowaną aktywność zwieraczy.

Ponieważ okres obserwacji podczas tego badania pilotażowego był ograniczony do 4 tygodni po SCI, jest nieco za wcześnie, aby spekulować na temat postępu sukcesu leczenia dla dłuższej obserwacji chronicznej. Ponadto, czy zmiany włókniste, które następują po początkowych deficytach funkcjonalnych, są również spowolnione lub zmniejszone, pozostaje do wyjaśnienia w przyszłości.

Jakie metody i wnioski płyną z eksperymentalnej analizy SCI?

Mimo że OUN jest uznawany za miejsce uprzywilejowane immunologicznie, SCI wywołuje przejściową ogólnoustrojową immunosupresję z szeregiem orkiestrowanych działań molekularnych i komórkowych w kontekście neurozapalenia. Nadal trwa debata na temat pozytywnych i szkodliwych ról neurozapalenia, ale podejścia przeciwzapalne wykazały pewną skuteczność w poprawie funkcji w modelach zwierzęcych SCI. Nie wiadomo, które konkretne aspekty ogromnego spektrum odpowiedzi neurozapalnych należy uwzględnić, aby wykorzystać jego pełny potencjał. Ponadto, wykorzystanie odpowiedzi zapalnej mogłoby być bardziej korzystne niż jej eliminacja. W tym badaniu eksploracyjnym skupiliśmy się na eliminacji cysteinyloleukotrienów podczas początkowej fazy SCI. Wcześniejsze badania wykazały, że poziomy leukotrienów są podwyższone po SCI w modelach gryzoni i psów oraz u ludzi.

Montelukast jest dobrze ugruntowanym i długoterminowo zatwierdzonym przez FDA lekiem przeciwastmatycznym, który, jak wiadomo, ma kilka korzystnych efektów na pęcherz moczowy. Doustne leczenie montelukastem znacznie zmniejszyło częstotliwość oddawania moczu i ból u pacjentów z śródmiąższowym zapaleniem pęcherza. Jeszcze bardziej istotne dla tego badania było odkrycie, że pojedyncza dootrzewnowa iniekcja montelukastu utrzymała integralność tkanki pęcherza po stłuczeniu SCI u szczurów po zaledwie jednym tygodniu SCI.

Tutaj mogliśmy potwierdzić, że opisane powyżej krótkoterminowe odkrycia są osiągalne w bardziej klinicznym ustawieniu z doustnym podawaniem klinicznie zatwierdzonej dawki montelukastu przez dłuższy okres czasu po SCI. Aby porównać farmakokinetykę montelukastu u zdrowego szczepu szczurów Lewis z ludźmi i innymi gatunkami zwierząt, monitorowano poziomy w osoczu w czasie. Podczas gdy stężenia w osoczu u zdrowych szczurów były porównywalne z tymi zgłaszanymi u myszy, szczurów i ludzi, były one znacznie niższe po urazie rdzenia kręgowego (SCI), choć nadal uważane za istotne dla wywierania efektu terapeutycznego. Stawiamy hipotezę, że po początkowym metabolizmie wątrobowym pierwszego przejścia znaczna ilość montelukastu jest dystrybuowana do tkanek takich jak rdzeń kręgowy i inne tkanki obwodowe dotknięte SCI, na przykład pęcherz.

Dodatkowo zaobserwowaliśmy znaczący wzrost poziomów montelukastu w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) przez cztery tygodnie po SCI, co może wskazywać na uszkodzenie bariery krew-rdzeń kręgowy. U zdrowych szczurów kontrolnych i ludzi stężenia w CSF są podobne (3,6 ng/ml u ludzi versus 2,7 ng/ml u szczurów), ale po SCI poziomy CSF u szczurów były sześć razy wyższe (wahające się około 18 ng/ml). W konsekwencji montelukast łagodzi neurozapalenie w rdzeniu kręgowym, co mogłoby korzystnie wpływać na funkcję narządów obwodowych. Jednak ze względu na całkowite przecięcie rdzenia kręgowego w naszym badaniu eksploracyjnym nie zaobserwowaliśmy podobnych wyników w miejscu urazu.

To badanie pilotażowe podkreśla wykonalność przewlekłego leczenia montelukastem nLUTD po SCI i pokazuje obiecujące zachowanie funkcji LUT przez cztery tygodnie. Podczas gdy efekty przeciwzapalne były oceniane tylko wstępnie za pomocą poziomów leukotrienów, te wyniki wspierają dalsze badania. Biorąc pod uwagę centralną rolę zapalenia w patologii SCI, przyszłe badania powinny lepiej zbadać mechanizm montelukastu i jego znaczenie dla terapii ukierunkowanych na pęcherz. Idealnie byłoby to zrobić podczas dłuższej obserwacji po SCI, aby objąć wszystkie etapy neurozapalenia i jego ustępowania, a także dalsze skupienie się na efektach terapii w rdzeniu kręgowym (np. na astrogiliozie). Ponadto analiza efektów MLK na nieuszkodzoną tkankę neuronalną mogłaby pomóc w określeniu pełnego efektu tego leczenia w przyszłości.

W tym badaniu potwierdziliśmy, że wszystkie metody były wykonywane zgodnie z odpowiednimi austriackimi rządowymi wytycznymi etycznymi dla eksperymentów na zwierzętach. Badanie to przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Austriacki Rządowy Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach. Zaświadczamy, że przestrzegano wspólnych wytycznych ARRIVE i wszystkich obowiązujących instytucjonalnych i rządowych przepisów, a także lokalnych wytycznych dotyczących etycznego wykorzystania zwierząt. W badaniu wykorzystano pięćdziesiąt samic, 3-miesięcznych szczurów szczepu Lewis z Charles River Laboratories. Po przybyciu wszystkie zwierzęta przeszły dwa tygodnie aklimatyzacji i przyzwyczajania się do obsługi. Zwierzęta zostały losowo przydzielone do jednej z następujących czterech grup: zdrowa grupa kontrolna bez leczenia montelukastem (CTRL-MLK; n = 5), kontrola z leczeniem montelukastem (CTRL + MLK; n = 5), grupa SCI bez leczenia montelukastem (SCI-MLK; n = 20), grupa SCI z leczeniem montelukastem (SCI + MLK; n = 20). Charakter badania był czysto eksploracyjny; dlatego nie uwzględniono zaślepienia ani grup z pozorowanym SCI.

W znieczuleniu ogólnym (mieszanina medetomidyny, midazolamu i fentanylu, domięśniowo), cewnik pęcherzowy PE-50 został wszczepiony przez kopułę pęcherza do pęcherza. Podskórnie tunelowany cewnik pęcherzowy był wyprowadzany na poziomie łopatek i przymocowany do uprzęży infuzyjnej. Zwierzęta pozostawały w tych uprzężach przez cały czas trwania eksperymentu. W celu pokrycia analgetycznego i antybiotykowego podawano Meloxicam i Baytril przez pierwsze pięć dni po operacji. Antybiotyki podawano w regularnych odstępach czasu przez cały okres obserwacji, aby uniknąć wstępujących infekcji z powodu stałego implantu cewnika. Podczas opieki pooperacyjnej po SCI pęcherze moczowe były ręcznie opróżniane dwa razy dziennie, wyciśnięty mocz był zbierany, a objętości były odnotowywane.

W znieczuleniu ogólnym (mieszanina jak opisano powyżej) wykonano standardową laminektomię na poziomie segmentu piersiowego T8/T9, a rdzeń kręgowy został całkowicie przecięty i optycznie zweryfikowany. Kawałek gąbki żelowej został użyty do zatrzymania krwawienia po przecięciu SC i pozostawiony na miejscu. Warstwy mięśni szkieletowych zostały następnie zszyte warstwami, a skóra została zamknięta. Pooperacyjne środki przeciwbólowe i antybiotyki podawano jak opisano powyżej przez pierwsze siedem kolejnych dni po SCI. Zwierzęta były ściśle monitorowane raz dziennie pod kątem ogólnego stanu zdrowia, w tym wagi, futra, oczu, poziomu aktywności i stolca. Pęcherz moczowy i lokomocja były oceniane oddzielnie. Tkankę rdzenia kręgowego wszystkich zranionych zwierząt ostatecznie oceniono, aby potwierdzić kompletność przecięcia rdzenia kręgowego.

Montelukast (FDA, Singulair®, numer aplikacji 20-829) podawano doustnie w standardowej dawce 10 mg/kg masy ciała (rozpuszczony w żelu metylocelulozowym). Leczenie rozpoczęto w pierwszym dniu po SCI i kontynuowano raz dziennie przez cały 28-dniowy okres obserwacji. Do analizy przytomne zwierzęta umieszczano w urządzeniu ograniczającym. Po podłączeniu cewnika do pompy strzykawkowej, podgrzany roztwór soli fizjologicznej był infuzowany do pęcherza ze stałą szybkością 120 µL/min. Infuzję utrzymywano do momentu zmierzenia co najmniej trzech cykli mikcji, ale przez co najmniej 45 min, gdy nie wystąpiło żadne zdarzenie mikcji. Główne parametry odczytu to minimalne ciśnienie wewnątrzpęcherzowe, ciśnienie progowe, maksymalne ciśnienie wewnątrzpęcherzowe, średnie ciśnienie, objętość oddanego moczu, czas mikcji i średni przepływ. Do oceny danych wszystkie parametry ciśnienia i mikcji analizowano na początku badania i po urazie w dpi 1, 7, 14, 21 i 28.

Szczurom pozwolono się swobodnie poruszać i były oceniane przez dwóch zaślepionych eksperymentatorów pod kątem ich zdolności do używania tylnych kończyn zgodnie z 21-punktową skalą lokomocji BBB. Analizowano ruch stawów szczura, umieszczenie łapy, podparcie ciężaru, kroki, koordynację przednich/tylnych kończyn, pozycję/stabilność tułowia i pozycję ogona na początku badania i po SCI w dpi 1, 15 i 29. Próbki pełnej krwi pobierano po jednej, trzech i siedmiu godzinach, a CSF dodatkowo pobierano po siedmiu godzinach po podaniu montelukastu, aby monitorować poziomy montelukastu w osoczu u zdrowych zwierząt. Ponadto próbki pełnej krwi i CSF pobierano raz w znieczuleniu ogólnym, trzy godziny po podaniu montelukastu przed eutanazją w 29. dniu obserwacji naszej grupy SCI. Próbki pełnej krwi przechowywano w temperaturze 4°C do momentu wirowania przy 1 rcf w temperaturze 4°C przez 10 min. Osocze pobierano i przechowywano w temperaturze -20°C do analizy chromatografii cieczowej-spektrometrii mas (LC-MS/MS). Próbki CSF przechowywano w temperaturze -80°C bezpośrednio po pobraniu do analizy.

W 29. dniu obserwacji po SCI zwierzęta były głęboko znieczulane dożylnie i przezkardialnie płukane zimną heparynizowaną solą fizjologiczną, a następnie utrwalane perfuzyjnie zimnym 4% paraformaldehydem (PFA) rozpuszczonym w buforze 0,1 M PO4. Po perfuzji wycięto kawałek bocznej ściany pęcherza o wymiarach 1 × 1 cm i utrwalano przez 2 h w 4% PFA przed dokładnym przemyciem i przechowywaniem w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS) z 0,05% azydkiem sodu w temperaturze 4°C do dalszego przetwarzania. Rdzenie kręgowe pobrano i przeanalizowano, aby potwierdzić kompletność przecięcia rdzenia kręgowego.

Próbki pęcherza zatopiono w parafinie poprzez rosnącą serię etanolu (70% do 100%), metylbenzoat i butylacetat, i seryjnie przecięto na 10 mm. Do badań histologicznych mięśni gładkich i włókien elastycznych wykonano barwienie Orceiną po wstępnej deparafinizacji. Barwione przekroje udokumentowano fotograficznie na skanerze slajdów, a następnie przeprowadzono analizę jakościową. Do analiz immunohistochemicznych odparafinowano przekroje z wcześniejszym odzyskiwaniem antygenów z 10 mM buforem cytrynianu sodu w gorącej łaźni parowej przez 15 min. Przeciwciało pierwotne (Anti-Uroplakin III) inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Po przemyciu, przeciwciało wtórne inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej. Barwienie jądrowe (DAPI, 5 min w temperaturze pokojowej) wykonano jako ostatni krok. Barwione przekroje udokumentowano fotograficznie na skanerze slajdów VS120.

Dane eksperymentalne przetwarzano za pomocą narzędzia do arkusza kalkulacyjnego i statystyki (GraphPad Prism) w celu obliczenia średnich wartości, odchyleń standardowych i istotności statystycznej. Dane analizowano za pomocą nieparzystego testu t z korekcją Welcha, używając dwustopniowej metody step-up z False Discovery Rate. Wartości p ≤ 0,05, ≤ 0,01 i ≤ 0,001 uznano za istotne i odpowiednio oznaczono na grafikach.

Podsumowując, nasze badanie pilotażowe wykazało, że montelukast, antagonista receptora cysteinyloleukotrienowego 1, może korzystnie wpływać na funkcję pęcherza moczowego po urazie rdzenia kręgowego poprzez zmniejszenie objawów dyssynergii wypieraczowo-zwieraczowej. U zwierząt leczonych montelukastem obserwowano niższe ciśnienia wewnątrzpęcherzowe, bardziej regularne mikcje i mniejsze objętości zalegającego moczu w porównaniu do nieleczonych zwierząt z SCI. Chociaż w tym wczesnym 4-tygodniowym punkcie czasowym nie zaobserwowano istotnych różnic strukturalnych w tkance pęcherza, nasze wyniki funkcjonalne sugerują, że montelukast może być obiecującym kandydatem do dalszych badań jako potencjalna terapia dla pacjentów z neurogenną dysfunkcją dolnego odcinka układu moczowego po urazie rdzenia kręgowego. Potrzebne są dalsze badania z dłuższym okresem obserwacji, aby ocenić długoterminowe efekty montelukastu na zmiany włókniste w pęcherzu i funkcję dolnych dróg moczowych po SCI.

Podsumowanie

Badanie pilotażowe przeprowadzone na szczurach wykazało, że montelukast – antagonista receptora cysteinyloleukotrienowego 1, stosowany w leczeniu astmy – może skutecznie wpływać na funkcję pęcherza moczowego po urazie rdzenia kręgowego. W trakcie 4-tygodniowej obserwacji u zwierząt leczonych montelukastem zaobserwowano niższe ciśnienia wewnątrzpęcherzowe, bardziej regularne mikcje oraz mniejsze objętości zalegającego moczu w porównaniu do grupy kontrolnej. Mimo że w tym wczesnym okresie nie stwierdzono istotnych różnic strukturalnych w tkance pęcherza, wyniki funkcjonalne sugerują potencjał terapeutyczny montelukastu w leczeniu neurogennej dysfunkcji dolnego odcinka układu moczowego. Mechanizm działania leku opiera się na jego właściwościach przeciwzapalnych i zdolności do hamowania szlaku leukotrienowego. Badanie potwierdziło także bezpieczeństwo stosowania montelukastu w dawce 10 mg/kg masy ciała oraz jego zdolność do przenikania do płynu mózgowo-rdzeniowego. Wyniki wskazują na potrzebę dalszych badań z dłuższym okresem obserwacji dla pełnej oceny skuteczności tej terapii.