Montelukast jako nowy lek przeciwwirusowy – przełomowe odkrycie w badaniach

Czy montelukast zmienia zasady gry w terapii przeciwwirusowej?

Montelukast wykazuje silne działanie przeciwwirusowe wobec wirusa RSV w badaniach in vitro

W obliczu rosnącej liczby epidemii wirusowych, w tym takich patogenów jak Ebola, wirus Zika, wirus Zachodniego Nilu, wirus dengi, MERS-CoV, wirus grypy A, SARS-CoV i SARS-CoV-2, poszukiwanie skutecznych strategii terapeutycznych staje się priorytetem. Wzrost tych zagrożeń jest uwarunkowany wieloma czynnikami, takimi jak zwiększająca się gęstość populacji ludzkiej, turystyka międzykontynentalna, działalność handlowa oraz globalne zmiany klimatyczne. Choć szczepionki odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu epidemii wirusowych, w początkowych fazach mogą być niewystarczające. W sytuacjach nagłych zagrożeń zdrowia publicznego, takich jak pandemia świńskiej grypy czy COVID-19, opracowanie leków o szerokim spektrum działania przeciwwirusowego, leków specyficznych dla konkretnych wirusów, a także poszukiwanie nowych zastosowań dla istniejących leków (repurposing) ma kluczowe znaczenie obok szczepionek.

Jak badania potwierdzają przeciwwirusowe właściwości montelukastu?

Naukowcy z Turcji przeprowadzili badanie, które rzuca nowe światło na przeciwwirusowe właściwości montelukastu (MLS) – znanego antagonisty receptorów leukotrienowych, stosowanego powszechnie w leczeniu astmy. Badacze wykorzystali model in vitro z bydlęcym wirusem syncytialnym (BRSV), który jest genetycznie i antygenowo podobny do ludzkiego wirusa syncytialnego (HRSV). Oba te wirusy należą do rodziny Pneumoviridae i rodzaju Orthopneumovirus, co czyni BRSV odpowiednim modelem zastępczym w badaniach nad potencjalnymi terapiami przeciwwirusowymi.

Mechanizm działania montelukastu opiera się na hamowaniu receptorów cysteinylowych leukotrienów (CysL-T), które odgrywają istotną rolę w regulacji przepuszczalności naczyń, powstawaniu obrzęków oraz wpływają na sygnalizację cytokin w komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi i limfocyty. Makrofagi pęcherzykowe płuc stanowią pierwszą linię obrony w zakażeniach dolnych dróg oddechowych, które mogą prowadzić do śmiertelnych uszkodzeń płuc. Komórki nabłonka pęcherzykowego typu 1 produkują leukotrien D4 (LTD₄), który zwiększa komórkowy wychwyt i replikację wirusa poprzez sygnalizację receptorów cysteinylowych za pośrednictwem CysL-T. W tym kontekście, regulacja komórek nabłonka pęcherzykowego przez makrofagi pęcherzykowe poprzez supresję LTD₄ może być ważną strategią w zwalczaniu zakażeń wirusowych dróg oddechowych.

Wcześniejsze badania wskazywały, że montelukast może mieć działanie przeciwwirusowe ze względu na jego wysokie powinowactwo do proteazy wirusowej niezbędnej do syntezy i replikacji RNA. Montelukast jest jednym z antagonistów receptorów CysL-T, który hamuje cytokiny prozapalne, takie jak IL-1β, IL-6 i TNF-α. Kilka badań oceniało jego działanie in vitro i in vivo przeciwko flawiwirusom, takim jak ZIKV i DENV, wirusowi syncytialnemu układu oddechowego (RSV) oraz wirusowi grypy A (IAV). Te badania wykazały, że MLS inaktywuje te wirusy we wczesnej fazie poprzez uszkodzenie błony lipidowej i genomu wirusowego. Lek hamował również ekspresję genomu wirusowego w IAV.

W przeprowadzonym badaniu naukowcy wykorzystali linię komórkową MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) oraz lokalny dziki szczep BRSV (GenBank no/Isolate: MT024767/43TR2018). Aby określić minimalne stężenie toksyczne montelukastu dla komórek MDBK, przeprowadzono test żywotności komórek metodą barwienia błękitem trypanu. Wyniki wykazały, że stężenia 10 μM i 20 μM montelukastu nie wykazywały znaczącej cytotoksyczności, z żywotnością komórek odpowiednio 89,2% ± 1,33 i 87,3% ± 1,7.

Dla oceny efektu przeciwwirusowego, badacze przeprowadzili inokulacje BRSV pod presją wybranych nietoksycznych stężeń leku oraz bez presji leku, synchronicznie, używając różnych 24-dołkowych płytek zawierających świeżo przygotowane komórki MDBK. Ponadto, medium zawierające nietoksyczne stężenia MLS było świeżo przygotowywane dla każdego z 10 pasaży przeprowadzonych w badaniu. Procedura ta była konsekwentnie powtarzana 10 razy, a po każdym pasażu przeprowadzano test zakaźności metodą TCID₅₀ (50% dawka zakaźna dla hodowli tkankowej), aby porównać zakaźność BRSV z i bez presji leku.

“Nasze wyniki wyraźnie wskazują, że montelukast w stężeniach 10 μM i 20 μM znacząco hamuje replikację BRSV w komórkach MDBK, z redukcją miana wirusa o co najmniej 2 log10” – piszą autorzy badania.

Czy wyniki eksperymentu przeciwwirusowego są przełomowe?

Co istotne, badacze przeprowadzili serię 10 pasaży wirusa pod presją montelukastu w dwóch stężeniach (oznaczonych jako MLS▲10BRSV i MLS▲20BRSV) oraz bez obecności leku (oznaczonego jako ∆BRSV). W każdym pasażu monitorowano efekt cytopatyczny (CPE) przez 72 godziny po inokulacji wirusem. Już w pierwszym pasażu zaobserwowano rozpowszechniony CPE w monowarstwach komórek MDBK po 72 godzinach od inokulacji wirusem. Po 10 pasażach rozprzestrzenianie się BRSV zostało znacząco ograniczone zarówno w przypadku MLS▲10BRSV, jak i MLS▲20BRSV.

Aby potwierdzić obecność BRSV w wybranych pasażach, przeprowadzono nested RT-PCR dla genu G wirusa BRSV. Oczekiwany amplikon o wielkości 371 par zasad odpowiadający regionowi genu G wirusa został wizualizowany za pomocą elektroforezy żelowej. Zarówno silne, jak i wyraźne prążki obserwowano w 1, 3 i 5 pasażu ∆BRSV, MLS▲10BRSV i MLS▲20BRSV. Prążek odpowiadający 371 par zasad dla 10. pasażu był znacznie słabszy dla MLS▲20BRSV w porównaniu do MLS▲10BRSV oraz ∆BRSV, co sugeruje niższą ilość materiału genetycznego wirusa.

Szczególnie imponujące były wyniki dotyczące redukcji liczby kopii wirusa. W pierwszym pasażu liczba kopii wirusa na μl została obliczona dla ∆BRSV, MLS▲10BRSV i MLS▲20BRSV odpowiednio jako 1,73 × 10⁹, 1,71 × 10⁸ i 1,06 × 10⁷. W dziesiątym pasażu, liczba kopii wirusa na μl wynosiła 2,16 × 10⁶ dla ∆BRSV, 1,54 × 10³ dla MLS▲10BRSV i 1,18 × 10³ dla MLS▲20BRSV. Oznacza to, że stężenia 10 μM i 20 μM montelukastu zmniejszyły liczbę kopii wirusa BRSV odpowiednio 1402-krotnie (99,92%) i 1830-krotnie (99,94%), osiągając około 99,90% hamowania wirusa. Czy te wyniki mogą przełożyć się na skuteczność kliniczną w leczeniu infekcji wirusowych u ludzi?

Badanie wykazało również, że montelukast ma działanie ochronne na komórki. W celu oceny apoptozy i nekrozy, wszystkie komórki barwiono Hoechst 33342 i jodkiem propidyny (PI) i wizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki inkubowano przez 15 minut w 37°C z barwnikiem Hoechst 33342, a następnie płukano trzykrotnie w buforze fosforanowym (PBS). Jodek propidyny dodawano tuż przed mikroskopią. Liczono i klasyfikowano minimum 100 komórek w trzech obszarach jako: (1) żywe komórki (normalne jądra: niebieska chromatyna o zorganizowanej strukturze); (2) komórki apoptotyczne z nienaruszoną błoną (jasna niebieska chromatyna, która jest silnie skondensowana, zmarginalizowana lub sfragmentowana); (3) komórki apoptotyczne z przepuszczalną błoną (jasna czerwona chromatyna, silnie skondensowana lub sfragmentowana); (4) komórki nekrotyczne (czerwone, powiększone jądra o gładkiej normalnej strukturze); i (5) komórki pykniczne/nekrotyczne (jasne czerwone, lekko skondensowane jądra czasami podzielone na 2-3 sfery).

W pierwszym pasażu, odsetek żywych komórek zakażonych ∆BRSV wynosił 21,00% ± 5,56%, podczas gdy w przypadku komórek zakażonych MLS▲20BRSV wzrósł do 40,00% ± 3,60%. W dziesiątym pasażu, odsetek żywych komórek zakażonych ∆BRSV wynosił 32,00% ± 8,88%, a w przypadku komórek zakażonych MLS▲10BRSV i MLS▲20BRSV wzrósł odpowiednio do 40,00% ± 4,58% i 41,33% ± 4,16%. Montelukast wykazał również działanie hamujące na odpowiedź nekrotyczną w zakażonych komórkach, co sugeruje jego potencjał w ochronie tkanek przed uszkodzeniami związanymi z infekcją wirusową.

Badacze ocenili również poziom tlenku azotu (NO) w komórkach, który jest stabilnym markerem odzwierciedlającym ilość wyprodukowanego NO. Szybkie utlenianie tlenku azotu generuje azotyn, który jest stabilny, a jego akumulacja w medium hodowlanym odzwierciedla ilość wyprodukowanego NO. W pierwszym pasażu, odpowiedź tlenku azotu komórek zakażonych ∆BRSV wynosiła 16,03 ± 0,28 µM/mL. Odpowiedź tlenku azotu zakażonych komórek MLS▲10MDBK wynosiła 16,03 ± 0,20 µM/mL, podczas gdy w zakażonych komórkach MLS▲20MDBK wynosiła 16,23 ± 0,11 µM/mL. W dziesiątym pasażu, odpowiedź tlenku azotu komórek ∆BRSV wynosiła 19,33 ± 0,63 µM/mL. Odpowiedź tlenku azotu MLS▲10MDBK wynosiła 19,76 ± 0,11 µM/mL, podczas gdy w MLS▲20MDBK wynosiła 14,96 ± 0,40 µM/mL. Te wyniki wskazują, że MLS miał hamujący wpływ na odpowiedź tlenku azotu w komórkach zakażonych BRSV, zależny od stężenia MLS, podczas gdy sam BRSV nie miał wpływu na odpowiedź tlenku azotu.

Czy montelukast otwiera nowe perspektywy w leczeniu infekcji?

Autorzy badania sugerują, że mechanizm przeciwwirusowego działania montelukastu może być związany z dwoma procesami: niszczeniem integralności wirusa poprzez zwiększone uwalnianie RNA BRSV indukowane przez montelukast i/lub celowaniem montelukastu w błonę lipidową BRSV. “Ostre spadki zarówno ładunku wirusowego, jak i miana wirusa w naszym badaniu można interpretować jako zależne od dwóch konsekwencji: niszczenia integralności wirusa z powodu zwiększonego uwalniania RNA BRSV indukowanego przez MLS i/lub celowania MLS w błonę lipidową BRSV” – wyjaśniają badacze.

Istotne jest również, że montelukast może zmniejszać pozapłucne objawy w COVID-19, albo bezpośrednio poprzez blokowanie receptorów Cys-LT w różnych narządach, albo pośrednio poprzez hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB. RSV jest silnym aktywatorem NF-κB, a montelukast jest silnym inhibitorem tego czynnika transkrypcyjnego. Badanie wykazało, że montelukast ma wyraźny hamujący wpływ na odpowiedź tlenku azotu, który jest markerem aktywacji NF-κB.

Warto zauważyć, że w miarę postępu zakażenia RSV, nekroza i niezorganizowana proliferacja nabłonka oskrzelików oraz zniszczenie komórek nabłonkowych stają się charakterystycznymi cechami zapalenia oskrzelików. Inną ważną cechą patologiczną zakażenia RSV jest obrzęk podśluzówkowy i nadmierne wydzielanie śluzu, które w połączeniu z resztkami komórkowymi i komórkami zapalnymi powodują niedrożność oskrzelików, uwięzienie powietrza i rozedmę. Upośledzenie wymiany gazowej prowadzi do hipoksemii, a w cięższych przypadkach do konieczności wspomagania oddechowego. W ciężkim RSV komórki zapalne gromadzą się w błonie śluzowej dróg oddechowych, ponieważ regulatory zapalne są stale uwalniane, a replikacja wirusowa wpływa na komórki nabłonkowe.

Jakie są implikacje kliniczne tych wyników? Montelukast jako lek zatwierdzony przez FDA o znanym profilu bezpieczeństwa może stanowić atrakcyjną opcję w leczeniu infekcji wirusowych, szczególnie tych atakujących drogi oddechowe. Jego podwójne działanie – przeciwwirusowe i immunomodulujące – może być szczególnie korzystne w łagodzeniu ciężkości choroby i zapobieganiu powikłaniom. Należy jednak pamiętać, że dawkowanie kliniczne leku jest ważne ze względu na możliwe skutki uboczne, szczególnie u dzieci.

Wyniki tego badania wskazują, że montelukast jest inhibitorem wirusowym, nie wywołuje apoptozy i ma łagodne działanie nekrotyczne. Wykazał 99% działanie przeciwwirusowe na BRSV w komórkach MDBK i ochronną rolę w tych komórkach. W konsekwencji, ścieżki przeciwwirusowego działania montelukastu zasługują na dalsze badania, szczególnie w kontekście potencjalnego zastosowania w leczeniu infekcji RSV u ludzi oraz innych wirusów oddechowych.

Warto zastanowić się, czy montelukast mógłby być rozważany jako uzupełnienie standardowej terapii w przypadku infekcji RSV u pacjentów z grup wysokiego ryzyka, takich jak niemowlęta, osoby starsze czy pacjenci z chorobami współistniejącymi. Czy jego zastosowanie mogłoby zmniejszyć ciężkość objawów i skrócić czas hospitalizacji? Te pytania wymagają dalszych badań klinicznych, ale wyniki przedstawione przez badaczy z Turcji stanowią obiecujący punkt wyjścia.

Repozycjonowanie leków, takich jak montelukast, może być inteligentną strategią w sytuacjach epidemicznych/pandemicznych, gdy skutki uboczne i powikłania są już znane. Wykorzystanie eksperymentalnego modelu zastępczego in vitro dla infekcji epidemicznej/pandemicznej odpowiada celowi medycyny translacyjnej – od laboratorium do łóżka pacjenta i od łóżka pacjenta do laboratorium. Montelukast, jako lek o potencjalnym działaniu przeciwwirusowym i immunomodulującym, może stanowić wartościowe narzędzie w arsenale terapeutycznym przeciwko infekcjom wirusowym dróg oddechowych.

Podsumowanie

\- Montelukast wykazał znaczące działanie przeciwwirusowe wobec wirusa RSV w badaniach in vitro, redukując jego replikację o około 99,90%
\- Stężenia 10 μM i 20 μM montelukastu zmniejszyły liczbę kopii wirusa BRSV odpowiednio 1402-krotnie i 1830-krotnie
\- Lek wykazał działanie ochronne na komórki, zwiększając odsetek żywych komórek z 21% do 40% w pierwszym pasażu
\- Mechanizm działania przeciwwirusowego może być związany z niszczeniem integralności wirusa i celowaniem w jego błonę lipidową
\- Montelukast wykazuje podwójne działanie: przeciwwirusowe i immunomodulujące
\- Jako lek zatwierdzony przez FDA o znanym profilu bezpieczeństwa, może stanowić potencjalną opcję w leczeniu infekcji wirusowych układu oddechowego

Bibliografia

Kurucay Hanne Nur, Yazici Zafer, Bayrakal Vahide, Muftuoglu Bahadir, Ozan Emre, Tamer Cuneyt, Gozel Seda, Barry Gerald, Igde Mahir, Okur-Gumusova Semra, Albayrak Harun, Elhag Ahmed Eisa and Baskin Huseyin. A surrogate in vitro experimental model for off-label drug repurposing: inhibitory effect of montelukast on bovine respiratory syncytial virus replication. Virology Journal 2025, 22(4), 145413-476. DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-025-02647-4.